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Subcultivo de una línea celular.



El término cultivo celular se refiere al mantenimiento de células disgregadas a partir de un tejido humano o animal bajo condiciones de laboratorio (in vitro). Esta tecnología se desarrollo a principios del siglo XX como una estrategia para estudiar el funcionamiento de la célula fuera del organismo, actualmente esta tecnología sigue aportando gran conocimiento sobre los mecanismos que regulan las funciones de la célula.

El cultivo celular ha permitido la aparición de nuevos modelos tecnológicos como la fertilización in vitro, producción de vacunas antivirales, la clonación, el almacenamiento y expansión de células madre. Una ventaja del cultivo celular es la capacidad de expansión final permitiendo sus uso a gran escala ya sea para la realización de experimentos o para la aplicación práctica; la técnica que permite esta expansión se conoce como células subcultivadas.

Las células en cultivo proliferan por los factores mitogénicos en el medio de cultivo el cual contiene nutrientes que favorecen su sobrevivencia. Un agente mitogénico es aquel que favorece la entrada al ciclo celular  y que estimula la formación de dos nuevas células, mientras las células tengan espacio suficiente y medio de cultivo estas seguiran creciendo hasta abarcar toda la superficie del cultivo.

Los cultivos se mantienen a 37 ℃ en una atmósfera de dióxido de carbono (CO2), se extrae el cultivo y se observa al microscopio (los oculares en este tipo de microscopio están debajo de las platinas para permitir observar las células adheridas al medio de cultivo).

Para realizar el subcultivo es recomendable que las células no llenen por completo la superficie de la caja debido a que estas disminuyen su capacidad proliferativa debido a mecanismos internos de autocontrol; debido a esto el subcultivo debe hacerse cuando las células han abarcado entre un 70 a un 80% de la superficie del cultivo, del mismo modo las células deben presentar un buen aspecto (nucleo celular definido, ausencia de vacuolas introcitoplasmicas, color transparente del cultivo sin turbidez).

El cabinete de seguridad biológica es el equipo que proporciona un área de esterilidad libre de bacterias y hongos para el cultivo de las células; su funcionamiento se basa en hacer pasar  el aire ambiental desde una serie de filtros conocidos como filtros EPA que retienen el 99.97% de las partículas presentes en el aire, el aire filtrado es lanzado al interior del gabinete  el cual ha sido previamente desinfectado proporcionando un área estéril en el momento de hacer el cultivo.

Una vez realizado este proceso ponemos los materiales a utilizar para realizar el subcultivo los cuales son:

  1. Medios de cultivo, hay que tener en cuenta que hay que tener estos medios a 37℃ por lo cual se utiliza el baño María.
  2. Utilizamos también  gradillas, pipetas serológicas y el pipeteador (todo este material debe estar estéril).   
El proceso se inicia sacando las células de la incubadora colocandolas en el gabinete de control biológico; el subcultivo se inicia eliminando el medio de cultivo de la caja, se agrega a la caja solución amortiguadora de fosfatos con el fin de eliminar restos del medio de cultivo, posteriormente se elimina la soulción amortiguadora de fosfatos; después de hacer el lavado se agrega al subcultivo una enzima proteolítica en este caso tripsina la cual tienen la capacidad de romper las uniones entre las células de tal manera que al final de la incubación tengamos células individuales en suspensión; el cultivo debes ser observado a los 5 minutos de incubación con la enzima para determinar el grado de degradación de las uniones de las células en donde nos podemos dar cuenta que las células no tienen puntos de unión (destruidos por la tripsina) viendosen redondas y en suspensión; para evitar que la enzima siga degradando la superficie de las células y siga dañandolas se le agrega medio de cultivo fresco el cual inactiva la tripsina.

Una vez inactivada la enzima el operador toma el volumen total del medio y lo proyecta sobre toda la superficie del medio de cultivo de tal manera que se despeguen las células restantes, el volumen total de medio de cultivo se pasa a un tubo el cual se lleva a la centrifuga con el fin de homogenizar y determinar su densidad.

Para determinar la densidad se utiliza la cámara de neubauer, realizamos un dilución 1/10 utilizando el colorante azul de tripano el cual nos permite determinar entre células viables y células muertas tomandose solamente las únicas células capaces de sobrevivir. Posteriormente de utilizar la cámara, la suspensión celular se coloca en una centrifuga con el objetivo de separar las células del medio de cultivo que contiene la enzima proteolítica, las células se concentran en el fondo del tubo debido a la fuerza centrifuga aplicada, el medio de cultivo se elimina decantandolo  en otro tubo y enseguida se agrega medio de cultivo fresco.

El conteo que se realiza en la cámara de Neubauer se hace en un área de 1 milímetro cuadrado utilizando el miscroscopio que mediante una fórmula establecida se determina el número de células por mililitro y a partir de este valor el número total de células en el volumen total de cultivo.

Conociendose la densidad de la suspensión celular (es decir el número células por militro) ahora se pueden sembrar el número de celulas que se van a estudiar; en un principio el subcultivo nos permite expandir las células las veces que el operador quiera, normalmente se siembran mayor número de cajas pero con un nivel de densidad menor de tal manera que las células puedan iniciar un nuevo ciclo de ploliferación.

Después del sembrado las células se sedimentan antes de ser revisadas y se observan al microscopio para saber que estan en buen estado, después de esto las células se introducen en la incubadora  a 37 a un 5% de dióxido de carbono (CO2), los cultivos se revisan todos los días hasta el nuevo ciclo de subcultivo.



Microbiología y bioanalismo.


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